Създаване на технология на генното инженерство

От 1973г.

Първоначалните експерименти, касаещи генното инженерство единствено показват, че е възможно да се осъществяват генни рекомбинации ин витро и че продуктът на рекомбинацията може да се накара да проникне както в бактериална клетка, така и в клетка на жив организъм. За да станат обаче тези резултати приложими за изучаване на гени на висши организми, било необходима да се разработи съвкупност от методи за изолиране на гените.

Изпробвани са два взаимно допълващи се подхода: първият се състои в повторното доказване на връзката на белтъците с гените. За тази цел трябвало да бъдат избрани клетки или органи , в които даден белтък синтезира много активно. Такъв е случаят с клетките - предшественици на червените кръвни телца, които синтезират големи количества хемоглобин. Именно тази система избира групата на Том Маниатис от Харвардския университет.

В гореспоменатите клетки има голям брой матрични РНК, кодиращи хемоглобина, които представляват значителна част от общия брой на матричните РНК-молекули: те могат много лесно да бъдат пречистени, да бъдат копирани ин витро от обратната транскриптаза в ДНК, наречена комплементарна, и после да бъдат включени в плазмид или във фаг и да се амплифицират в бактериите.

В този подход има един двоен недостатък. От една страна, така получените гени не са функционирали, тъй като не притежават нормални регулаторни гени не са функционални, тъй като не притежават нормални регулаторни сигнали и по-специално ДНК-последователностите, наричани промотори, разположени преди гена, които позволяват на РНК-полимеразата и копието да разпознаят гена в матричната РНК. От друга страна, тази процедура е приложима само за изолирането на гени, кодиращи белтъци представени в големи количества.

Методът, известен като клониране, е развит от групата на Дейвид Хогнес, работеща върху винената мушица Дрозофила. Те се опитват да изолират гените, за които от предишни генетични анализи се е знаело, че играят важна роля за развитието на дрозофилата, но белтъчния им продукт бил недостатъчен и слабопознат, даже по-точно - непознат. При този метод геномът се фрагментира случайно или се накъсва от рестрикционни ензими, а фрагментите се интегрират в плазмиди или фаги, които след това се интегрират в бактерии. Такава бактериална популация се нарича геномна "банка" или "библиотека".

Банките или библиотеките са полезни само ако е възможно, изхождайки от тях, да се изолира бактерия или бактерии, които са интегрирали плазмид или фаг, съдържащ гена, или изследваната комплементарна ДНК.

Крайъгълният камък в основата на генното инженерство е рекомбинацията ин витро на ДНК-молекулите. Без никакво съмнение вторият основен камък е техниката на клонирането. Но генното инженерство не би постигнало такова развитие, ако съвкупността от нови методи или усъвършенстването на експериментите.

Този напредък  е плод на работата на различни изследователски групи. Обединяването им превръща  генното инженерство в ефикасна технология.

С развитието  на изследванията върху човешкия геном се създават новите методи на клониране, на картиране и отделяне на ДНК-фрагменти с голям размер.

Първият етап от всяко изследване по генно инженерство е изолирането и амплифицирането на гените или на пречистените фрагменти на ДНК. След като веднъж този етап е осъществен, на изследователя му остава да опише така очистената ДНК-молекула и да състави, физическа карта с рестрикционните ензими, но най-вече да определи реда на тези нуклеотиди, тяхната "последователност". Последната операция става лесна след едновременното създаване през 1977 на две конкурентни техники на секвестиране - тази на американците А. Максим и У. Гилбърт от една страна, и на англичанина Фредерик Сенджър, от друга.

След като един ген на висш организъм е пречистен, характеризиран и евентуално модифициран ин витро, той трябва да бъде отново интегриран в клетките, в които произхожда, за да се изучат неговите експресия и функция. Още от шейсетте години експериментите са показали, че ДНК може да прониква в еукариотните клетки.

При все това ефикасността на преноса, както и устойчивостта на инкорпорираната ДНК, са  незначителни. Използването на животински вирус като вектор е потенциално опасно, тъй като обикновено избраните  вируси са обикновено са онкогени, а освен това ограничават размера на ДНК-фрагментите, които са манипулируеми.

През 1973 ф. Греъм и А. Ван дер Ерб създават нов метод, който подобрява проникването на ДНК. През 1979 година е описана процедура на трансфекция със селекционен ген, позволяващ изолирането на клетки, които са интегрирали екзогенна ДНК. Този експеримент отваря пътя за получаване на клетъчни потомства, устойчиви спрямо модифицирана генетична наследственост. Това е фундаментален за генното инженерство метод.

През 1982 година се появява трудът, изготвен след провеждането на опит в лабораторията Колд Спринг Харбър. Озаглавен е Молекулно клониране, лабораторен наръчник. В него по достъпен начин е описан и стандартизиран начина за прилагане на методите на генното инженерство и с това отбелязва първата фаза на постиженията в тази насока.