Дигитално сканиращи повърхността лазерно-флуоресцентни микроскопи

От 22.07.1993г.

Изображенията  на развиващи се ембриони, получени с дигитално сканиращи повърхността лазерно-флуоресцентни микроскопи (DSLM) са разработени в лаборатория на "Stelzer". Дигиталните 3D изображения на ембрионите и развиващите се анатомични органи могат да се наблюдават, като отделните участъци се оцветяват в различен цвят. Например в отделен ембрион може да се наблюдава миграцията на клетки от различни посоки, като всяка от тях е оцветена по следния начин: клетъчна миграция към гърба (в цвят циан), вентрална клетъчна миграция (зелен), миграция към гръбначната хорда (червен) или извън нея (жълт).

Въпреки огромният напредък в историческото развитие на светлинната микроскопия визуализирането на по-големи биологични структури в триизмерно (3D) изображение на този етап е все още проблемно. Снимки, направени на тънки хистологични участъци не предоставят достатъчно подробна информация за територията и състава им, а по този начин не може да се прилага върху живи екземпляри.

Още повече неинвазивното разглеждане на оптично напречно сечение на пробата (например при конфокалната микроскопия) предоставя ограничена дълбочина на изображенията на големите обекти. Това е така, защото аксиалната ('z') резолюция по своята същност е много по-ниска в сравнение с латералната. Това затруднение може да се разреши с осветяване под ъгъл от 90°, сключен със специална светлинна повърхност.

Идеята за съставянето на осветена само от едната страна проба със специална светлинна повърхност за пръв път в историята е описана през 1903, но не е проучена добре. Това се случва през 1993 година с развиването на метода на сегментиране чрез флуоресценция в ортогоналната равнина. Именно и тогава е съставен първият дигитално сканиращ повърхността лазерен флуоресцентен микроскоп от Филип Келер.

При описания по-горе подход пробата е сегментирана на определени участъци от тънка светлинна повърхност, която е направена чрез цилиндрична микроскопска леща. Осветената повърхност е проектирана на равнинна плоскост, която е прозрачна, а флуоресцентно маркираната проба се разполага перпендикулярно на определена ос. Поради факта, че само едната страна на пробата, разположена на равнинната плоскост е осветена, никаква светлина не се излъчва от области извън фокусната равнина. Следователно не съществуват нефокусирани части в наблюдаваната половина. Другата половина на пробата става видима след завъртане, а докато се върти микроскопът прави серия от снимки, отразяващи детайли от различен ъгъл.

Методът на действие на дигитално сканиращи повърхността лазерни флуоресцентни микроскопи предлага огромен потенциал за детайлното визуализиране на големи проби. Развитието на този тип микроскопи от историческа гледна точка е помрачено в известна степен, защото те не са се произвеждали с комерсиална цел. Използват се единствено от малки изследователски групи.
През 2002 системата на дигитално сканиращия повърхността лазерен флуоресцентен микроскоп е подобрена. Става възможно визуализирането на водни бактерии в естествената им среда.

През 2004 година Стелцер и негови колеги развиват до такава степен своя микроскоп, че могат да наблюдават живи ембриони.
Микроскопията със селективно-равнинно светлинно обозначение (SPIM) предлага 3D изображения с висока резолюция, отразяваща в дълбочина развитието на живите ембриони. Още повече фототоксичността намалява с времето, защото е осветена само едната половина на  наблюдавания ембрион.

Благодарение на това се преодолява още една пречка – вече може ембриогенезата да се следи за дълги времеви периоди. И  действително, през 2008 година Стелцер и неговите колеги представили подобрена версия на SPIM-микроскопа, която можела да представи 24-часовото развитие на ембриони на риба, записвайки миграцията и деленето на всяко клетъчно ядро.

Статията е част от историята на:

• История на микроскопа