Създаване на флуоресцентен микроскоп, епи-флуоресцентен микроскоп и диоптрично огледало

От 6.5.1911г.

Аугуст Кьолер е изключително вдъхновен от откритието на Ернст Аббе, който твърди, че по-късите светлинни вълни постигат по-висока разделителна способност (резолюция). Това кара Кьолер да задълбочи собствените си познания.
През 1904 той създава първият ултравиолетов микроскоп в град Йена, Германия в компанията "Zeiss Optical Works". Инструментът използвал УВ светлина, доставена от лампа с кадмиева дъга, която позволявала да се направят фотографски изображения на пробите с резолюция, два пъти по-голяма от тази на светлинния микроскоп. Кьолел също забелязал, че при употреба на УВ светлина някои проби започват излъчват с по-голяма дължина на вълната.

Физикът Оскар Хаймщат през 1911 година използва наблюденията на Кьолер като основа за направата на първия добре функциониращ флуоресцентен микроскоп. Хаймщат осъществил две базисни идеи – концентрирал достатъчно УВ светлина върху пробата, за да я направи флуоресцентна и премахнал съпровождащият шум от излъчващата се УВ светлина. Ученият желае да подобри предишния флуоресцентен микроскоп като използва за пръв път кювети, конструирани от Ханс Мориц Лийман и изолира УВ светлината от бялата светлина, излъчвана от лампата с кадмиева дъга. За да се концентрира върху това той използва затъмнено осветление, което гарантира нулево светлинно възбуждане. Така светлината не би могла да достигне до лещите в обектива и да наруши флуоресцентния контраст.

Хаймщат успешно успява да изолира бактерия, но той не е убеден изцяло, че флуоресцентната микроскопия ще съумее да си извоюва трайно влияние. Той завършва изследването си с думите: "Ако и до каква степен флуоресцентната микроскопия успее да  развие приложението ще зависи единствено от бъдещето". Действително, да се разчита на автофлуоресценцията от изследващите се проби е ненадеждно и изисква подаване на светлина от затъмнени кондензатори. Това до някъде ограничава приложението на този тип микроскопи.

Впоследствие ограниченията във флуоресцентните микроскопи са преодолени през следващите две десетилетия, когато австрийският изследовател Макс Хайтингер и още учени  развиват техника чрез вторична флуоресценция, която включва екзогенни флуоресцентни химикали при третирането на пробите. Хайтингер за пръв път въвежда и термина "флуорохром".
Флуорохромът е от съществено значение за флуоресцентната микроскопия в живите тъкани, също колкото развитието на изследвания с разсеяна светлина в епи-флуоресцентната микроскопия. При нея източникът на светлина лежи на същата страна, на която е разположена пробата и обектива. По този начин светлинно възбудената емисия преминава през обектива. Това разположение позволява по-голямо възбуждане на пробата, като по този начин и по-непрозрачните проби стават ясно различими.  

Прототип на епи-флуоресцентен микроскоп е конструиран през 1929 година от немския фармаколог Филип Елингер и анатома Аугуст Хирт. При наречения от тях интра-витален микроскоп възбудената светлина преминава през серия от филтри, преди точната светлинна дължина да достигне до обектива и лещите. След това тази светлина се насочва и излъчва към наблюдаваната тъкан. Жълт бариерен филтър, разположен между обектива и окуляра предпазва и предотвратява най-силно отразената възбудена светлина да не пречи на наблюдението.

Друга голяма иновация се въвежда 40 години по-късно, когато са конструирани първите диоптрични огледала. Те, вместо да абсорбират определени светлинни вълни (както традиционните филтри), отразяват тясна част от тях, докато предават всички останали. Това позволява осветяването на пробата с прецизно насочена светлинна вълна, което гарантира, че никаква възбудена светлина не достига до окулярите.

Немският учен Йохан Себастиян Плоем е тясно свързан с развитието на този тип огледала и описва разсеяното вертикално осветяване с дихроматични огледала през 1967 година. Застопорена под ъгъл от 45° постъпващата възбудена светлина се отразява с 95% по-къса светлинна вълна, но предава от своя страна по-голяма дължина на вълната към обектива. Отразеният лъч  възбудена светлина след това прониква в обектива , който изпълнява и ролята на кондензатор, гарантиращ възбуждането на наблюдаваната проба. Излъчваната по-дълга флуоресцентна светлинна вълна се събира в обектива, преминава обратно към него и се връща през дихроматичното огледало и бариерния филтър в окулярите.

Дихроматичното огледало преобразува епи-флуоресцентния микроскоп от инструмент, който може единствено да се използва от специално обучени специалисти в универсален и незаменим уред за много медицински изследователи. 

Статията е част от историята на:

• История на микроскопа