Дву-фотонен микроскоп

От 10.2.1990г.

Една от големите мечти на хората, работещи с микроскопи, е да успеят да визуализират клетките от по-дълбоко разположените тъкани в живи проби. Достигането на тази цел е възпрепятствана от наличието на блясък, който разфокусира изображението, което допълнително размазва изображението, създаващо се с конвенционалните епи-флуоресцентни микроскопи. При конфокалните лазерно-сканиращи микроскопи нефокусираните фонови области са елиминирани чрез много малки дупчици, но големият обем от възбудени светлинни вълни означава, че вълновото ограничение на светлинното разсейване намалява възможността за редуциране на този ефект.

При дву-фотонната микроскопия светлинното възбуждането е ограничено до линията на фокусния обем и така флуоресцентното откриване е по-малко чувствително от разсейването на светлината.
Дву-фотонната абсорбция е широко обсъждана тема в квантовата оптика и за пръв път е описана от докторската дисертация на Мария Гопферт-Майер през 1931 година. Тридесет години по-късно Кайзер и Гарет наблюдават дву-фотонна абсорбция в кристали.

Дву-фотонното светлинно възбуждане е резултат от две почти едновременни усвоявания на фотони от една молекула. Дължината на светлинно възбудената вълна трябва да бъде почти два пъти по-голяма от тази, която се изисква за едно-фоттонно възбуждане, защото фотонната енергия е обратнопропорционална на светлинновълновата дължина. При дву-фотонната микроскопия лазерен лъч се насочва към пробата, което повишава вероятността флуорофорът да премине във възбудено състояние, за да може лазерният фокус да сканира обекта в зрителното поле и да създаде изображение. Първият дву-фотонен микроскоп е създаден пре 1990 година.

Учените Денк, Стриклър и Уеб използват за пръв в историята път методите на дву-фотонната микроскопия, за да визуализират хромозоми в живи клетки. Денк и неговите сътрудници адаптират техниката и започват да изследват неврони in situ (на място). Това изследване през 1997 година разгръща пълния потенциал на този тип микроскопи.
Чрез ограничаването на фокусния обем дву-фотонният лазерно сканиращ флуоресцентен микроскоп позволява правилното прехвърляне на фотони от пространствената позиция, от която произлизат. Употребата на светлинновъзбудени вълни  с голяма дължина и намаляването на разсейването, причинено от светлинното възбуждане позволява да се оформят изображения с около десет пъти по-голяма дължина от нормалния конфокален микроскоп. В допълнение дву-фотонното възбуждане значително намалява ефектите на фоторазпад и фотоувреждане, което го прави идеално за неинвазивно изследване на ембриони и органи.

Статията е част от историята на:

• История на микроскопа