Флуоресцентната микроскопия с пълно вътрешно отражение

От 7.4.1976г.

Възможността да се наблюдават ярките флуоресцентни молекули на тъмен фон с флуоресцентната микроскопия, чрез която се оцветява полето се осъществява благодарение на молекулярната специфичност на наблюдаваните частици. Това предполага, че с флуоресцентната микроскопия ще се локализира точното място на единичните молекули.

Потвърждението на тази теория идва, когато през 1976 година Томас Хирсфелд използвал флуоресцентен микроскоп. Той локализирал мястото на определени единични молекули, обвързани с десетки флуорофори, които преминават през тънък светлинен слой. За съжаление на този етап все още съществуват някои ограничения, затрудняващи напредъка. Въпреки това, през следващите две десетилетия учените стават свидетели на локализирането на  единични флуорофори на ниски температури, преминаващи през фокусиран лазерен лъч.

През 1993 година тази ситуация се променила, когато Ерик Бетциг и Робърт Чичстър постигат изображение на единични флуорофори на стайна температура с нов вид микроскоп, наречен NSOM (near-field scanning optical microscopе), сканиращ високоскоростно чрез сондиране на изключително малки участъци в пробата. Това осигурява локализацията, точния молекулярен мащаб и ориентация. Потенциалът, заложен в едномолекулните сканирани изображения за съжаление не е особено приложим за биологичните проби поради високата си степен на инвазивност и сложност.

През 1995 година Тошио Янаджида и негови колеги използват и оптимизират устройството на флуоресцентен микроскоп с пълно вътрешно отражение, за да визуализират единични миозинови молекули маркирани с флуорофор. Основната им цел е да видят преобразуването на АТФ (аденозинтрифосфат), маркиран с различен флуорофор. За разлика от предишните методи, използващи имобилизирани молекули, това изследване показа, че изображенията с флуоресцентен микроскоп с пълно вътрешно отражение на много молекули във воден разтвор за период от няколко секунди преди избелването му демонстрира пригодността му биологична употреба.

През 1998 г. Съни Хий провежда изследване, включващо присъединяване на ФАД (флавинадениндинуклеотид) в активния център на холестерол оксидаза. Неговата цел е да се разкрие, че тази ензимна активност е повлияна от своеобразната молекулна памет, съхранена в протеина. Това поведение е напълно неочаквано за Хий и останалите, провели експеримента и показва недвусмислено, че флуоресцентната микроскопия с пълно вътрешно отражение може да хвърли нова светлина върху привидно добре характеризираните микроскопски системи. Подобни ензимно-оборотни анализи, разработени от други групи в крайна сметка води до определяне на последователността на отделните молекули ДНК.

Статията е част от историята на:

• История на микроскопа